Y迷宮實驗

Y迷宮實驗可用于評估小鼠的短期記憶。通過允許小鼠探索迷宮的所有三個臂，可以評估自發(fā)交替行為——一種空間工作記憶的測量，這是由嚙齒動物天生想要探索以前未訪問過的區(qū)域的好奇心驅動的。一只具有完整工作記憶的小鼠，因此具有完整的前額葉皮質功能，將記住以前訪問過的臂，并傾向于進入最近訪問較少的臂。空間參考記憶，由海馬支持，也可以通過在訓練期間將試驗小鼠放入Y迷宮并關閉一個臂來測試。例如，在1小時的試驗間隔后，小鼠應該記得它以前沒有探索過的臂，并且應該更頻繁地訪問這個臂。本章描述了進行這兩個相關測試并解釋結果之前的條件、所需材料和協(xié)議。

一、 引言

阿爾茨海默病是最常見的癡呆形式，其特點是認知功能的逐漸衰退。據估計，它影響了超過60歲年齡組的6-8%的個體。臨床前的小鼠模型在測試癡呆和認知障礙的潛在病理生理學以及篩選和開發(fā)新藥治療方面已被證明是有用的。本章描述了兩種行為測試，用于檢測工作記憶和參考記憶，可以使用同一設備——一個封閉的Y迷宮來進行。

基于其設計基礎，Y迷宮可用于評估小鼠的短期記憶。例如，自發(fā)交替，一種測量空間工作記憶的方法，可以通過允許小鼠自由探索迷宮的所有三個臂來評估，這種行為是由嚙齒動物探索以前未訪問過的區(qū)域的天生好奇心驅動的。一個具有良好工作記憶的小鼠將記得它已經訪問過的迷宮的臂，并將傾向于進入最近訪問較少的臂。這需要大腦的幾個不同區(qū)域，如海馬和前額葉皮質之間的互動。測試是使用一個Y形迷宮進行的，迷宮有三個淺色的、不透明的臂，它們以120°的角度相互定位。小鼠在迷宮上的特定位置引入，并允許在短時間內自由探索臂。當小鼠的所有四肢都在一個臂內時，認為發(fā)生了進入臂的行為。交替定義為連續(xù)并且不重復的進入所有三個臂。然后，記錄臂入口和交替的次數(shù)，以計算交替行為的百分比。高百分比被視為良好的工作記憶，因為這表明小鼠已經回憶起它已經訪問過的臂。

空間參考記憶可以通過在訓練期間將測試小鼠放入Y迷宮并關閉一個迷宮臂來測試（訓練協(xié)議）。這個臂被為新穎臂。在一定的時間間隔（試驗間隔，ITI）后，期間將小鼠從迷宮中移除，然后在移除障礙物后將小鼠重新放入迷宮（測試協(xié)議）。ITI的長度將強烈影響動物在這項任務中的表現(xiàn)，因為較長的ITI需要更高的記憶負載。常用的小鼠品種通常在最多4小時的ITI下在這項任務中表現(xiàn)良好。一些研究者使用24小時的ITI來探索長期空間記憶。小鼠應該基于遠端空間線索及其與Y迷宮中自己當前位置的關系，記住它以前沒有探索過的臂，并且應該比其他臂更頻繁地訪問這個新穎臂。然后將進入新穎臂的次數(shù)與進入其他臂的次數(shù)進行比較，以評估空間記憶的程度。在測試會議期間，對任何臂都沒有偏好的小鼠表示空間記憶受損，這可能表明海馬功能受損。

二、實驗材料

1.實驗和對照小鼠（見注釋1）。

2.稱重秤。

3.測試室及相鄰操作員座位的房間（見注釋2）。

4.淺灰色聚氯乙烯（PVC）Y形隔間（21 × 7 × 15.5厘米），三個臂長相等（圖1）。

5.用來阻擋迷宮一臂的隔板。

6.迷宮周圍的三個視覺線索標志物（見注釋3）。

7.容器裝Y迷宮，以防老鼠逃跑。

8.攝像頭/相機（見注釋4）。

9.支架用來將攝像頭放置在迷宮上方的較高位置。

10.visutrack行為學分析軟件（見注釋5）。

11.噴霧瓶裝有70%的乙醇和紙巾（見注釋6）。

三、實驗前的準備

1.實驗前至少7天讓小鼠適應，以便所有動物熟悉房間、工作人員、氣味和噪音（見注釋7）。

2.在行為學研究的早上稱量小鼠并記錄信息，包括研究標題和小鼠品系。

3.使用乙醇噴霧瓶和紙巾確保Y迷宮在測試前清潔。

4.清潔后確保迷宮干燥。

5.將攝像頭放置在Y迷宮上方的支架上，并通過延長USB線纜連接到電腦（見注釋8）。

6.在測試前1小時將小鼠放入行為測試室中，讓它們適應條件。

四、 短期記憶的測試——自發(fā)性交替

1.標記迷宮的三個臂為A、B和C。

2.讓行為學軟件與Y迷宮相機連接成功并調整清晰度，全面的拍攝到迷宮里的老鼠。

3.將測試動物放置在標有A的臂的遠端，面向迷宮中心，輕輕地抓住尾巴的基部。

4.離開測試室。

5.讓小鼠自由探索迷宮5/8/10分鐘。

6.停止錄像并保存文件。

7.將小鼠從迷宮中取出，放回原籠。

8.在進行下一個動物之前，清潔迷宮的所有墻壁和地面。

9.實驗結束并測試了所有的小鼠后，將所有小鼠放回保持室中的家籠。

10.清潔所有設備并收拾好。

11.檢查視頻并記錄所有進入臂的次數(shù)和交替次數(shù)（見注釋9）。

12.使用以下公式計算百分比（%）交替：

五、 空間參考記憶測試——新穎臂測試

1.小鼠適應期后，如上述標記迷宮的三個臂為A、B和C。

2.用隔板關閉其中一個臂（圖2）（見注釋10）。記錄哪個臂被關閉。

3.通過USB采集卡纜將攝像頭連接到電腦并開始錄像（見注釋8）

4.將動物面向中心放入一個開放的臂中，并記錄動物被放置在哪個臂（見注釋11）。

5.離開行為測試室。

7.按下visutrack軟件的的開始分析鍵，并計時15分鐘。

8.讓動物自由探索迷宮15分鐘。

9.15分鐘后，停止錄像。

10.將測試小鼠返回其飼養(yǎng)籠。

11.移除隔板。

12.等待1小時（或預設的ITI所需的時間長度）并再次開始錄像。

13.用VisuTrack設置定時器為5分鐘。

14.將相同的測試小鼠放置在之前試驗中使用的同一臂的遠端，面向迷宮中心。

15.離開測試室并按下定時器的開始鍵。

16.讓動物自由探索迷宮5分鐘。

17.停止錄像并保存文件。

18.將小鼠從迷宮中取出，放回家籠。

19.在進行下一個動物之前，清潔迷宮的所有墻壁和地面。

20.實驗結束時，將所有小鼠返回保持室，清潔所有設備并收拾好。

21.使用Visutrack軟件分析測試期間進入所有臂的總行走距離。

22.識別迷宮的起點、新穎的臂和其他臂，并記錄每個臂的進入次數(shù)以及在每個臂中停留的時間（見注釋12）。

六、注釋

1.選擇的小鼠種類應該能代表認知或記憶障礙/增強的某個方面，例如慢性應激模型、加速衰老的遺傳模型或潛在記憶增強藥物的測試。最重要的是，所有程序應得到相應機構的批準。

2.使用單獨的房間很重要，因為它最小化了操作者干預或對測試結果產生不當影響的可能性。在此基礎上，測試期間設施內的環(huán)境噪音應盡量減少。同樣重要的是，動物保持區(qū)域內也應滿足此條件，因為噪音可能會增加動物的壓力水平，并導致認知障礙。

3.這些可以是圓形和方形的圖片，用來幫助老鼠識別與新奇性相關聯(lián)的迷宮臂。確保作為遠距離空間線索的物體在實驗過程中不會移動。

4.使用攝像頭是為了能遠程觀察所有情況。同樣，這有助于最小化直接觀察者可能對測試結果產生的不當影響。

5.用于分析動物行為的軟件。也可以使用其他軟件，但操作者應確保所需的輸出測量值包含在其特性中。

6.這僅僅是為了在測試運行前和期間清潔迷宮，因為殘留的氣味和物質可能會影響測試結果。

7.同樣，這是所有行為學研究中應采取的步驟，以減少動物的壓力，從而提高研究結果的可重復性和準確性。此外，至少在行為測試前24小時，設施內不應進行動物的淘汰或采血。在整個行為測試過程中應保持低環(huán)境噪音。

8.在電腦屏幕上檢查圖像時，確保可以看到迷宮的所有區(qū)域。

9.如果老鼠用全部四只爪子進入迷宮的一個臂（A、B或C），則記錄為一次進入。交替定義為老鼠連續(xù)進入所有三個臂。為了識別自發(fā)交替，使用了重疊技術。例如，A–C–B–C–A的模式包含兩次交替。

10.用于阻塞的臂應隨機選擇，并在小鼠間輪換。

11.這也應在不同的運行和測試小鼠之間隨機化。

12.具有完整空間參考記憶的老鼠應該進入并在新奇臂中花費的時間比迷宮的其他臂多。然而，我們和其他人注意到，小鼠在研究初期傾向于在起始臂逗留，因此這個臂可能被排除在比較基準之外。空間參考記憶受損的小鼠將無法識別新奇臂，因為它們無法回憶起在研究預運行階段哪個臂被阻塞。記憶受損表現(xiàn)為對新奇臂和其他臂的區(qū)分缺失。